引物長(zhǎng)度：

引物長(zhǎng)度通常在15～30bp之間，常用的為18～27bp。

不建議引物長(zhǎng)度大于38bp，因?yàn)檫^長(zhǎng)的引物可能導(dǎo)致與模板DNA的結(jié)合能力下降，并且最適延伸溫度可能超過Taq DNA聚合酶的最適溫度（74℃），從而影響產(chǎn)物的特異性。

GC含量：

G+C含量應(yīng)在40%～60%之間，以45%～55%為宜。

上下游引物的GC含量應(yīng)保持接近，以確保Tm值（熔解溫度）相近，使得復(fù)性條件最佳。

Tm值：

引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值應(yīng)在72℃左右，這有助于優(yōu)化PCR反應(yīng)條件。

避免自身互補(bǔ)：

引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)避免含有自身互補(bǔ)的堿基序列，以防止引物之間形成二聚體，影響PCR擴(kuò)增效率。

避免特定結(jié)構(gòu)：

引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)盡量避免出現(xiàn)二硫鍵或普魯文結(jié)構(gòu)（如三個(gè)或四個(gè)相鄰的G或C堿基），這些結(jié)構(gòu)可能影響引物的穩(wěn)定性和PCR擴(kuò)增效率。

修飾：

在引物的3'端末端，可以引入一些修飾，如磷酸化或5-末端的過氧化磷酸，以提高合成效率和PCR反應(yīng)的特異性。

發(fā)貨形式默認(rèn)1mg/管發(fā)貨，不分裝?？蛻羰盏胶罂梢匀芙夥盅b冷凍，一次取用一管。

ddH2和生理鹽水

根據(jù)來(lái)源和性質(zhì)的不同，分為基因組探針、cDNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針

1. 成本

考慮降低成本的情況，水解探針和蝎形探針是很好的選擇。與目前市面上所有的熒光探針相比，水解探針是目前市場(chǎng)上可靠，而且便宜的一種，如TaqMan和MGB探針。蝎形探針由于引物的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，不需要開發(fā)和購(gòu)買單獨(dú)的探頭，成為一個(gè)方便且具成本效益的選擇。

2. 時(shí)間

考慮時(shí)間的情況，蝎形探針是首選解決方案。不僅引物和探針存在于一個(gè)發(fā)卡結(jié)構(gòu)分子上，而且可以在快速循環(huán)條件下工作。水解探針也是理想的，因?yàn)樗鼈兎浅？煽?，問題發(fā)生頻次最低。這些往往被廣泛用于高通量擴(kuò)增分析。

3. 特異性

如果目標(biāo)序列很少，可以考慮分子信標(biāo)探針和雙雜交探針。當(dāng)結(jié)合到目標(biāo)時(shí)，分子信標(biāo)探針發(fā)射的熒光量通常比在自由溶液中釋放的光量大100倍。雙雜交探針有兩個(gè)探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，可以有更高的特異性。

特異性：確保siRNA序列特異性靶向目標(biāo)基因，避免脫靶效應(yīng)。

有效性：篩選具有高沉默效率的siRNA序列。

穩(wěn)定性：優(yōu)化siRNA序列以提高其在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性和有效性。

1. 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：如基因敲除、基因沉默等。

2. 藥物研發(fā)：用于開發(fā)新的藥物候選物，或優(yōu)化現(xiàn)有藥物的藥效和安全性。

3. 基因編輯：如CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)，需要特定的ASOs作為引導(dǎo)序列。

4. 臨床診斷：用于診斷疾病的生物標(biāo)志物檢測(cè)等。

病毒載體的滴度測(cè)定通常采用qPCR、ddPCR、ELISA、TEM或基于細(xì)胞的感染實(shí)驗(yàn)等方法，以確定病毒顆粒的數(shù)量或感染單位。

宿主細(xì)胞的選擇取決于病毒載體的類型和目標(biāo)應(yīng)用，常用的宿主細(xì)胞包括HEK293T、HeLa、COS-7等，這些細(xì)胞系易于培養(yǎng)且適合病毒的復(fù)制和包裝。

病毒顆粒通常在-80℃以下儲(chǔ)存，并在運(yùn)輸過程中使用干冰或冰袋保持低溫，以保持病毒的活性和穩(wěn)定性。

簡(jiǎn)單來(lái)說，原核基因編輯相差不大，我們目前使用的是CRISPR/Cas9基因編輯。真核Cas12a更有優(yōu)勢(shì)。

與Cas9相比：

1 Cas12蛋白小，質(zhì)?；虻鞍赘菀走M(jìn)入細(xì)胞

2 從經(jīng)濟(jì)方面來(lái)講，Cas12a用crRNA進(jìn)行編輯，crRNA約40-44nt，其合成的價(jià)格遠(yuǎn)低于sgRNA(約100nt)

3 識(shí)別位點(diǎn)PAM序列不同。Cas12a核酸酶識(shí)別5’-TTTV，切割產(chǎn)生交錯(cuò)末端。Cas9切割產(chǎn)生平末端